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12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠／次），培養(yǎng)皿（直徑10cm),DMEM+10%新生牛血清，15cm或50cm離心管（圓底），PBS配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手術刀、鑷子、剪子等器械。
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1.一般操作
(1)在培養(yǎng)皿中，解剖出鼠胚，以Hanks溶液消洗。
(2)除掉四肢、大腦及內臟（肝臟）。
(3)用無菌Hanks溶液＋PBS漂洗3次。
(4)置培養(yǎng)皿中，用手術剪切碎。
(5)將剪碎組織移入50ml離心管中，加入約10ml消化液。
(6)37°C搖育10min（置水浴或孵育箱中）。
(7)吸5ml上清液放入另一50ml離心管中，加等體積含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和胰蛋白酶。
(8)再加入4ml消化液至原離心管（內含組織），顛倒搖動，10min后再吸出5ml上清液到另一離心管中，加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
(9)重復上一步驟5次左右，此時離心管中僅剩無法消化的軟骨等。
(10)離心50ml離心管，加50ml含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
(11)取適量移到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
(12)第二天換液，直到細胞長滿（匯合），1:10傳代，再生長至合適密度時可進行凍存。
(13)根據(jù)實驗需要復蘇細胞，由于MEF細胞傳代數(shù)有限，實驗時應盡可能保留相同代數(shù)的細胞進行平行實驗。
2.處理或γ-射線處理用作飼養(yǎng)層的MEF細胞還須進行處理或干射線處理，步驟如下。
?。?）處理
復蘇凍存的MEF細胞(5×104個/cm2，保證用時滿滿一層，不留空間。
匯合狀態(tài)下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml絲裂霉紊的DMEM培養(yǎng)液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h。
以PBS漂洗數(shù)次，胰蛋白酶消化，以每分鐘1000轉的速率離心5min,收集沉淀，用新培養(yǎng)液懸浮，調整濃度為3×105g個/ml。
將細胞接種于經明膠預處理的培養(yǎng)皿中。（明膠預處理：0.1％明膠溶液浸泡2h,移走多余的明膠，待自然干燥。）
(2)γ-射線處理
匯合狀態(tài)的MEF細胞，以30~100Gy的γ－射線處理。
胰蛋白酶消化，收集細胞，離心（每分鐘1000轉，10min)、計數(shù)，接種到明膠預處理的培養(yǎng)皿中。Y-射線處理過的細胞也可以5×106個／ml的濃度凍存起來。復蘇后，1支凍存管可接種到4~5塊直徑6cm的培養(yǎng)皿中。
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